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Significado

La regulación del posicionamiento de los husillos mitoticos es un proceso clave para la arquitectura del tejido, el desarrollo embrionario y las células madre. Hasta la fecha, la mayoría de los modelos han asumido que los husillos están colocados por fuerzas ejercidas por redes polares de citoesqueleto, como los asters de microtubulo o los paquetes de la acción. Aquí, utilizando tweezers magnéticos in situ para aplicar fuerzas y torques calibrados a husillos mitóticos en células de erizos de mar divisorias en vivo, encontramos que las propiedades viscoelásticas del medio de citoplasma en el que las husillos están incrustadas pueden contener husillos en su lugar y moverlos de nuevo si su posición original es perturbida. Estas fuerzas viscoelásticas son grandes y pueden participar significativamente en el equilibrio de fuerza que posiciona y oriente husillos mitóticos en muchos tipos de células.


Resumen

Las células están llenas de macromoléculas y redes polímeros que establecen propiedades viscosas y elásticas dependientes de la escala al citoplasma. Aunque se reconoce cada vez más el papel de estos parámetros en la difusión molecular, la cinemática de reacción y la bioquímica celular, se desconocen sus contribuciones al movimiento y posicionamiento de organeles más grandes, como husillos mitóticos para la división celular. Aquí, utilizando pinzas magnéticas para desplazar y rotar husillos mitóticos en embriones vivos, descubrimos que el citoplasma puede impartir fuerzas reactivas viscoelásticas que mueven husillos, o objetos pasivos con tamaño similar, de vuelta a sus posiciones originales. Estas fuerzas son independientes de generadores de fuerza citosceletal, pero alcanzan cientos de piconewtons y escala con el abarrote de citoplasma. Las cuchillas de movimiento husillo y fluidiza el citoplasma, disipando la energía elástica y limitando los retrocesos de husillo con implicaciones funcionales para divisiones asimétricas y orientadas. Estos hallazgos sugieren que las propiedades materiales de citoplasma masiva pueden constituir elementos de control importantes para la regulación de la posición de división y la organización celular.


El citoplasma es un material compuesto heterogéneo lleno de grandes complejos macromoleculares, endomembranas y redes citosceletales enredadas (1, 2). Estos establecen una jerarquía de tamaños de poro y malla, que definen propiedades reológicas, como la viscosidad y elasticidad, que impactan procesos fundamentales que van desde la cinemática de reacciones bioquímicas hasta el transporte vesicular y el control de la forma celular (3 (3–5). La importancia de las propiedades materiales de citoplasma para la fisiología celular ha sido reconocida y estudiada durante décadas, empezando por los experimentos de microrheología temprana de Crick o Hiramoto (6⇓–8). Estos mostraron que las cuentas micrométricas inyectadas desplazadas en el citoplasma presentan respuestas viscoelásticas típicas, con retroalimentación posicional parcial que las mueven hacia su posición inicial. Por lo tanto, el citoplasma presenta comportamientos sólidos y fluidos, con modulos elásticos a granel en el orden de √1 a 10 Pa, típicos de geles blandos y viscosidades 100 a 1.000 veces el del agua. Estudios más recientes han establecido ahora que estas características reológicas exhiben tamaño, fuerza o dependencia de frecuencias y proporcionaron descripciones más refinadas del citoplasma utilizando marcos de viscoselasticidad no lineal o poroelasticidad (2, 3, 9⇓-11). El tamaño de objetos es de particular relevancia, dado que los componentes que flotan en el citoplasma pueden oscilar entre cuatro y cinco órdenes de magnitud. De hecho, se ha propuesto la reología del citoplasma para pasar de la de un líquido Newtoniano para partículas pequeñas a la de un sólido más cristalino o elástico para elementos más grandes (11, 12). Hasta la fecha, sin embargo, muchos estudios de propiedades de citoplasma a granel y sus funciones se han centrado en objetos relativamente pequeños, dejando el problema fundamental de cómo impactan el movimiento de grandes organelas, como nuclei o citoesqueletos, mal explorados.


El husillo mitotico es una asamblea tan grande que reside en una ubicación precisa en el citoplasma para especificar la citokinesis y así el tamaño y la posición de las células hija en los tejidos (13, 14). Las husillos se construyen a partir de microtúbulos dinámicos (MT) y motores y pueden tomar partes significativas del espacio celular. Se asocian comúnmente con redes de filamentos intermedios nucleares y endomembranas que forman una matriz de husillo llamada (15, 16). Estas consideraciones sugieren que su movimiento en el citoplasma denso podría estar asociado con grandes arrastres viscosos y elásticos, con implicaciones potenciales para posicionamiento de división y segregación cromosómica. Hasta ahora, sin embargo, la literatura que cubre la mecánica de posicionamiento de husillo ha sido dominada por el papel de las fuerzas dirigidas activas de las redes citosqueléticas polares (13, 14, 17). Las husillos pueden, por ejemplo, decentro o girar durante divisiones asimétricas o orientadas, un proceso típicamente asociado con fuerzas generadas por redes de la existenciamyosin contractil (18, 19) o MTs astrales y motores asociados como la disnea (20). Para las divisiones simétricas, las husillos mitóticos residen establemente en el centro celular. Se cree que esto está regulado por las MAT que crecen para contactar con los límites de las células y ejercer fuerzas de empujación y/o tirando de longitud en la husillo: cuando las husillos se vuelven incentrados, las asimetrías en las longitudes y fuerzas de MT actúan como un resorte efectivo relacionado con la forma celular a las husillos más recientes (21⇓⇓⇓–25). Las fuerzas netas aplicadas por los asters de MT o las redes de actmyosina pueden variar de pocas decenas a cientos de piconewtons (pN) (26⇓–28). Un desplazamiento de un objeto impermeable con el radio de una husillo de R = 5 μm por una distancia d = 5 μm, típica de muchas divisiones asimétricas, en un medio con un módulo elástico de G = 1 Pa, como el citoplasma, generaría una fuerza reactiva F = 6πR * G * d ¬500 pN. Así, las propiedades viscoselasticas del citoplasma podrían en principio ser muy relevantes para la mecánica de posicionamiento de husillo. Hasta la fecha, sin embargo, la falta de ensayos adecuados para probar la reología del citoplasma a escala de una husillo móvil ha perjudicado la prueba de este problema fundamental para la organización celular.


Aquí, explotando grandes células de erizo de mar, donde los asters mitóticos son demasiado cortos para llegar a la superficie celular, establecemos y cuantificamos la contribución directa de la viscoelasticidad del citoplasma a granel a la mecánica de posicionamiento de husillo. Utilizamos husillos o grandes gotitas de aceite pasivo movidos y rotados por pinzas magnéticas calibradas en células intactas para sonda viscosidad y elasticidad de citoplasma a la vez y la longitud representativa de movimientos husillo comúnmente observados en divisiones asimétricas o orientadas. Encontramos que el estrés ejercido por el husillo en el citoplasma hace que fluya y deforme y ejerza grandes fuerzas reactivas de primavera que retrocedan a este gran organela hacia su posición inicial. Los flujos de escala celular también desgarran y reorganizan el citoplasma, disipando la energía elástica y haciendo depender el tiempo de reposición de husillos, lo que facilita la rotación sobre los movimientos de husillo de traducción. Nuestros resultados colocan la reología del citoplasma como un elemento hasta ahora no apreciado en el equilibrio de la fuerza que controla el posicionamiento de la husillo mitótico y potencialmente otros organeles grandes.


Resultados

Viscoelastic Fuerzas Mantener la posición de giro de metafase Incluso en la ausencia de las MTs Astrales Contactar con el Cortex.

En muchas células pequeñas, las husillos mitóticos se conectan a la corteza celular por MTs dinámicos, que actúan como generadores de fuerza dominantes para mantener o modular la posición de husillo (29). En células más grandes, los límites del tamaño de la husillo pueden evitar que los asters metafáticos atados lleguen a la superficie celular (30⇓⇓⇓–34). Utilizando microscopía confocal inmunofluorescencia y Airy-scan para detectar MAT individuales astrales alrededor de husillos metafase de 95-μm-size zygotes de erizos de mar, computamos una distancia media de MTs astrales +tips a la corteza rica en actina de 14.5 +/− 9.8 μm (+/− SD), que corresponde al huevo. De los 4000 MTs rastreados, encontramos una media de sólo 3,35 +/− 3,4 MTs/celular que llegó dentro de 5 μm de la superficie de huevo, una distancia típicamente mayor que la corteza de actina en estos huevos (Fig. 1 A y B) (35). Estos resultados se confirmaron mediante la visualización de MTs en células vivas con diferentes sondas, así como con microscopía electrones de transmisión de huevos fijos con métodos optimizados para revelar MTs (SI Apéndice, Fig. S1 A–D) (36). En contraste agudo, y como se informó anteriormente, los asteres interfase y anafosa/telofase abarcaron toda la célula con una media de 373 +/− 12 y 408 +/− 33 MTs/cell alcanzando una distancia inferior a 5 μm a la superficie, respectivamente (Fig. 1C y SI Apéndice, Fig. S1E) (30, 33). A pesar de la falta de contacto MT con la superficie celular, el husillo apareció en gran parte estático en el centro celular en posición y orientación sobre la duración típica de la metafasa de 10 minutos o más escalas de tiempo más largas de hasta 35 a 40 minutos cuando la metafasa se prolongó con el inhibidor proteasome MG132 (Movie S1). Así, las husillos metafas pueden mantener su posición y orientación durante largos períodos de tiempo, incluso en ausencia de MTs astrales que se pongan en contacto con la corteza celular.


" data-icon-position=" data-hide-link-title="0" Fig. 1. Las fuerzas viscosas sostienen husillos en el centro de células grandes, incluso en ausencia de MTs astrales con contacto con la corteza celular. (A, Izquierda) Imagen confocal de aire de un zygote de erizo de mar en metafasa fija y manchada para MTs, ADN y F-actin. (Derecho) Cerrar vista en + extremos de MTs, marcados con puntas de flecha blancas, y la corteza rica en actina. (B) Quantification of the distance from MT+ TIPS to the actin cortex (n = 168 MT de cuatro huevos). (C) Número de MTs alcanzando una distancia inferior a 5 μm de la corteza en diferentes fases del primer ciclo celular (n = 3, 20, 5 y 2 células, respectivamente). Las barras de error corresponden a +/− SEM. (D y E) Lapso de tiempo de las husillos metafases con cuentas magnéticas atadas a un polo de husillo, desplazadas por fuerzas magnéticas aplicadas paralelamente al eje de husillo por la presencia de una punta del imán, y recogiendo sobre el cese de la fuerza. (F) Evolución del tiempo del desplazamiento medido desde la posición inicial centrada de la husillo reescalado por la fuerza aplicada para los husillos de metafasa en las células normales (n = 11) y en las células tratadas con MG132 para detener las células en metafase (n = 9). (G) Evolución del tiempo del desplazamiento de regreso al centro celular cuando la fuerza externa es liberada, reescalculada al desplazamiento en el momento del cese de la fuerza, para las mismas células y condiciones que en F. (H y I) Tiempo-lapso de husillos metafase desplazados y rotados por fuerzas magnéticas aplicadas ortogonal al eje de husillo y recogimiento de hus sobre el cese de la fuerza. (J) Evolución del tiempo del desplazamiento medido desde la posición inicial centrada de la husillo y reescalado por la fuerza aplicada en las células normales (n = 14) y en las células tratadas con MG132 (n = 7). (K) Evolución del tiempo del desplazamiento reescalculado de regreso al centro celular cuando la fuerza externa se libera para las mismas células y condiciones que en J. (L) Evolución del tiempo del ángulo del eje de la husillo reescalado por el par externo aplicado en las células normales (n = 14) y en las células tratadas con MG132 (n = 7). (M) Evolución del tiempo del ángulo reescalculado cuando el par externo se libera para las mismas células y condiciones que en L. En F y G y J-M, las líneas atrevidas corresponden a los ajustes de los datos utilizando ecuaciones generales de riguroso o relajación del modelo viscoelástico Jeffreys (ver texto principal y Materiales y Métodos). Las barras de error se representan como tonos en estas curvas y corresponden a +/− SD / 2 (Rejas de escala, 20 μm).


Para modular directamente la posición y la orientación de los husillos, implementamos en luminabsp; vivo pinzas magnéticas para aplicar fuerzas y pares a husillos en células vivas (26). Inyectamos un tipo específico de cuentas magnéticas en huevos no fertilizados y agregamos esperma para desencadenar la fertilización (28, 37). Estas cuentas exhiben movimiento centrípeta espontáneo a lo largo de los asters de MT y forman agregados compactos que permanecen unidos a los centrosomas a través del ciclo celular en estas células, permitiendo la aplicación de fuerzas magnéticas en los centrosomas acercándose a una punta magnética. Estas cuentas también forman agregados en bordenbsp;vitro, que permite la calibración de la fuerza magnética como función de tamaño agregado y distancia a la punta del imán, mediante el seguimiento de velocidades de cuentas en fluidos viscosos de prueba (37). La presencia de cuentas en postes de husillo no afectó las dimensiones de la husillo y no tuvo ningún efecto notable en la progresión del ciclo celular (SI Apéndice, Fig. S1 F y G). En algunos embriones, las cuentas a menudo se dividen en dos agregados después de la duplicación del centrooma en la interfase o profase temprana. En otros, las cuentas sólo rastrearon un centrosome, permitiendo una aplicación de fuerza puntiaguda en un solo polo de husillo (SI Apéndice, Fig. S1 H y I). Usando esas fuerzas, aplicamos fuerzas externas que van desde los años 70 a 700 pN a lo largo de diferentes ejes y monitoreamos el movimiento de husillo resultante. Tirando el husillo paralelo a su eje largo hizo que el husillo se tradujera hacia la punta del imán, mientras que una fuerza aplicada ortogonal al eje de la husillo causó movimientos tanto traduccionales como rotacionales que tendían a alinear el husillo a lo largo del eje de la fuerza magnética (Fig. 1 D, E, H, y I y Películas S2 y S3). Por lo tanto, estos experimentos permitieron la recapitulación de movimientos de husillo típicamente observados en divisiones asimétricas o orientadas con fuerzas calibradas y pares en células intactas.


Los MTs astrales que crecen a la corteza, para empujar o tirar sobre husillos, pueden actuar eficazmente como un sistema elástico activo relacionado con la forma celular que trae de vuelta una husillo al centro celular si su posición está perturbiada (21, 23). En nuestro sistema, donde los husillos carecen de MTs alcanzando límites celulares, anticipamos una respuesta viscosa a las fuerzas aplicadas sin retroalimentación posicional elástica. Para probar esto, desmoronamos curvas de desplazamiento de los tiradores individuales de husillo bajo diferentes magnitudes de fuerza al rescalar el desplazamiento de husillo por la fuerza (26). Este rescalamiento también permitió compensar pequeñas variaciones ( ~10 a 20%) en fuerzas externas durante cada tirada. Strikingly, estas curvas reescaladas de desplazamiento de husillos se movieron paralelamente o ortogonal a su largo eje exhibieron una respuesta viscoelástica típica: el movimiento de husillo fue primero lineal a corto plazo por debajo de 10 a 30 s, siguiendo un régimen viscoso, con una velocidad inicial proporcional a la fuerza aplicada, pero luego se ralentizó, dando una inflexión en la curva de desplazamiento Indicativa SIJ En consecuencia, las fuerzas más grandes dieron mayores desplazamientos en un momento fijo en el régimen de inflexión, y cuando la fuerza fue liberada, el husillo retrocedió (Fig. 1 G y K y SI Apéndice, Fig. S1K). También observamos que a más largo plazo escalones por encima de ¬100 a 200 s, la curva tendía a converger en otro régimen lineal. Además, los retrocesos sólo eran parciales, con husillos recuperando ¬40 a 60% de sus desplazamientos iniciales, a menudo dando una pequeña asimetría en el posicionamiento de los planos de división (Fig. 1 G y K). Estos comportamientos reflejan disipaciones significativas en la energía elástica almacenada.


Las dinámicas rotativas de las husillos enviadas a las torcas magnéticas también exhibieron una respuesta viscoelástica, pero los retrocesos elásticos aparecieron menos pronunciados que en la traducción, causando husillos a inclinarse y manteniendo su orientación final en el momento de la liberación de la fuerza (Fig. 1 L y M). Importantly, similar responses were obtained in cells arrested in metaphase with MG132, ruling out putative contributions of aster regrowth and initial cortex contact in late metaphase. Los ensayos de tirada de husillo también se limitaron a un pequeño desplazamiento suficiente que aseguraba que los asters mitóticos no se pusieran en contacto con la corteza, y la recienteización de husillo no mostraba ninguna correlación con la distancia final a la corteza (Fig. 1 F, G, y J-M y SI Apéndice, Fig. S1L). Por lo tanto, aunque estos datos no pueden rechazar firmemente un papel menor de las MTs que se ponen en contacto con la corteza, sugieren que la mayoría de esta respuesta viscoselastica puede atribuirse a elementos del citoplasma. Juntos, estos resultados sugieren la existencia de fuerzas viscoelásticas de restauración que mantienen posición y orientación de husillo, incluso en ausencia de MTs que llegan a la corteza celular.


La reposición de husillo es utilizada por las fuerzas de restauración viscoselasticas del material de citoplasma a granel.

Para comprender el origen de estas fuerzas viscoelásticas de restauración, probamos el papel de las MT como generadores de fuerza prominentes para posicionamiento de husillo. Desplazamos husillos con pinzas magnéticas y rápidamente enjuague células con Nocodazole para afectar a las MTs y monitoreamos la capacidad de los husillos para recuperar la espalda (Fig. 2A). En los controles, la recuperación posicional siguió un único exponencial con una escala de tiempo descompuesto de 103 +/− 92 s y una compensación posicional de 43 +/− 24%. Los husillos tratados con nocodazol brillan en tamaño para eventualmente desmontar durante un período de √5 a 10 min pero recuperaron sus posiciones con dinámicas similares y compensaciones como controles (Fig. 2 B-D y SI Apéndice, Fig. S2 A-E). Por lo tanto, de acuerdo con la falta de MTs que alcanzan límites celulares, la polimerización astral MT empujando o tirando fuerzas en la corteza o en el citoplasma parecen ser prescindibles para reposicionar husillos al centro celular.


" data-icon-position=" data-hide-link-title="0" Fig. 2. Las fuerzas de restauración viscoselas se asocian a las propiedades materiales del citoplasma a granel. (A y B) Las husillos de metafasa se desplazan con pinzas magnéticas y se tratan con DMSO (sulfóxido de dimetilo) como controles (n = 5) o Nocodazol para afectar a las MTs (n = 5 células), y su comportamiento de recogimiento al centro de celda es ensayado. (C y D) Cuantificación de los offsets posicionales al centro de celdas, a escalas de tiempo y descaimiento τ1 de curvas de relajación trazadas en B, utilizando un único modelo exponencial como se indica en el Inset en B. (E) Esquema que representa gotas de aceite inyectado que contienen cuentas magnéticas hidrofóbicas utilizadas para actuar objetos grandes con pinzas magnéticas en el citoplasma. (F) Time-lapse of a magnet oil droplet displaced with an external magnet force and recoiling upon force cease. (G) Time evolution of the displacement measure from the initial position of the droplet and rescaled by the applied force (n = 5 cells). (H) Time evolution of the rescaled displacement of the droplet back to its initial position upon force cease. (I y J) Escamas de tiempo de relajación y decaimiento para husillos metafase (n = 15) y gotas de aceite (n = 8). (K) Final vertical offset plotted as a function of the initial vertical offset for droplets displaced horizontally with magnética tweezers and let to relax (n = 8). La línea es un ajuste lineal con una pendiente de 1.04. (L) Midsection of a fixed metaphase zygote imaged with SBF-SEM and corresponding pixel classification of different endomembrane compartimentos in the cytoplasm and close up view at the border between the spindle and the rest of the cytoplasm. (M) Imagen confocal proyectada de un zygote metafase fijo y manchado para MTs, ADN y ER. Las barras de errores y tonos representan +/− SEM y +/− SD / 2, respectivamente. Los resultados se compararon con una prueba Mann-Whitney U de dos colas. n.s, P ≤ 0,05, ****P = 0,0001 href="#F2"(Fig. 2L).


Para establecer más directamente que las fuerzas de reposición viscoelásticas son independientes de elementos citosceletales asociados a husillo, buscamos recapitular los ensayos de microrheología temprana realizados por Crick o Hiramoto (6⇓-8) pero utilizando objetos que tienen tamaños similares como husillos mitóticos. Inspirados en experimentos recientes realizados en ovocitos de ratón y en extractos de Xenopus (27, 38), incrustamos las cuentas magnéticas hidrofóbicas en aceite de soja e inyectamos grandes gotas de aceite de 30 a 35 μm para moverlas en el citoplasma con pinzas magnéticas. Utilizamos a propósito huevos no fertilizados para evitar la presencia de grandes asters o husillos que podrían afectar el movimiento de gotas en el citoplasma de la hindrancia esterica o generando flujos activos y tensiones (39) (Fig. 2 E y F). En ausencia de fuerzas externas, las gotas de aceite fueron inmóviles en el citoplasma durante largas duraciónes de hasta 1 h, como los núcleos femeninos en estos huevos no fertilizados (SI Apéndice, Fig. S2 F-K). Cabe destacar que las gotas exhibieron una respuesta viscoelástica a fuerzas externas similares a las husillos, con una velocidad inicial constante rápida seguida por un régimen elástico saturante. Tras la cesación de la fuerza, las gotas retrocedieron hacia sus posiciones iniciales con compensaciones similares como husillos pero a corto plazo. Los retrocesos viscoelásticos de las gotas ocurrieron a lo largo del mismo camino recto que durante la aplicación de la fuerza, incluso cuando la gota fue contrarrestada del centro de la célula, indicando que este comportamiento elástico no está restringido a objetos colocados inicialmente en el centro de la célula (Fig. 2 G-K y Movie S4). Estos datos sugieren que los elementos del citoplasma a granel pueden generar fuerzas reactivas viscoelásticas que mueven los husillos o objetos pasivos de tamaño similar de vuelta a sus posiciones iniciales.


Aunque las husillos mitóticos se ven a menudo como redes polares hechas de filamentos MT, la acumulación de organeles membranosos u otros filamentos intermedios nucleares en su red MT ha sugerido la existencia de una matriz de husillo, que podría hacer que sean más físicamente similares a un gotero impermeable (15, 40). En consecuencia, al realizar la microscopía de escaneo facial de bloques de serie (SBF-SEM), encontramos que los husillos estaban cubiertos por endomembranes empaquetados, con un "reloj de cáscara de cebolla" típico de redes de reticulum endoplasmático mitótico (ER) (41) (Fig. 2L y Movie S5). Esta acumulación endomembrana es fácilmente evidente en imágenes DIC (microscopia de contraste de interferencia diferencial) como un área lisa alrededor de husillos (Movies S1–S3). La inmunofluorescencia validó aún más esta acumulación, y la segmentación de membranas ER proporcionó una estimación de un tamaño de poro superior de 0,2 a 0,5 μm entre membranas (Fig. 2 L y M). Por lo tanto, las husillos metafase pueden ser impermeables a objetos y redes relativamente grandes, una propiedad que como las gotas de aceite les permite ser arrastrados por flujos viscoelásticos y fuerzas del citoplasma de granel.




References:

https://theyellowdogproject.com/buying-clenbuterol-to-losing-weight-quickly-why-slow-and-steady-wins-the-race/

C

Contribución Del Citoplasma Propiedades Viscosas A La Posición De La Husillo Mitótica

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